Мембраналардың ассиметриясы
Барлық мембраналық құрылымдар жасушалар отграничивают біршама көлемі (қуысына мембраналар) ортаның немесе басқа бөліктері жасушалар. Бұл әлбетте жағдайларда мембраналық құрылымы бар қарапайым геометриялық пішінді, приближающуюся — сфералық, мысалы осындай нысаны ретінде плазматической мембраналар. Бірақ бұл әділ және мембраналардың күрделі конфигурациялы сияқты, мембрана митохондриялар, әсіресе эндоплазма-энергетикалық ретикулума, тілімі жалпақ кешені. Демек, әрбір мембранасы бар ішкі және сыртқы бетінің.
Бетінің бір мембраналар ерекшеленеді құрамы бойынша липидтердің, ақуыздар мен көмірсулардың (көлденең асимметрия). Мысалы, плазматической мембране эритроциттердің сыртқы монослое қос липидтік қабатының басым фосфатидилхолины, ал ішкі — фосфатидилэтаноламины және фосфатидил-серины. Көмір бөлігінде гликолипидов мен гликопротеинов шығады сыртқы бетіне, кейде құрай отырып тұтас жабын жасушалары » деп аталатын ерекше глико қорғанысты каликс; ішкі бетінде көмірсулар жоқ. Белоктар болып табылатын рецепторлардың гормондардың және басқа да сыртқы сигналдық молекулалар орналасады, сыртқы бетінің плазматической мембрана, жасуша ішіне сигнал беріледі қатысуымен белоктар ішкі бетінің мембраналар.
Барлық биологиялық мембраналар асимметричны, және түсіну оңай неге: өйткені олардың әрқайсысы екі бетінің, омываемые әртүрлі орталармен. Мысал ретінде келтіруге болады плазматическую мембрана, обращенную бір тарап цитоплазму, ал екіншісі — внеклеточное кеңістік. Дәл трансмембранная асимметрия, дифференцирующая две половинки бислоя, негіздейді сезімталдығы мембраналар өзгеруіне ортаның екі жағы. Әлбетте, бұл асимметрия мембраналық белоктар әдісіне байланысты қандай сол немесе өзге белок енгізілді қр мембрана. Жылдамдығы «флип-флопа» ақуыздардың бислое пренебрежимо аз. Мембраналық липидтер да орналасқан асимметрично. Ең айқын бұл көрсетілді үшін эритроциттердің. Қандай липид артуын түзейтін күтімі асимметрия, және ол қалай сақталады — қазіргі уақытта көбінесе түсініксіз. Бір жағдайларда маңызды рөл атқарады физикалық факторлар, атап айтқанда, қисықтық мембраналар, басқа айқындайтын салым енгізеді өзара іс-қимыл цитоскелетом немесе АТР-тәуелді ферментоподобных «флипаз».
Анық, бұл басқа трансмембранной асимметрия мембранам тән және латеральная негомогенность. Беттік мембранасы көптеген эукариоттық жасушалар қатты поляризована және нақты айқын жылжымалы бөліктер бетіндегі макроскопиялық домендер. Мысал ретінде келтіруге болады базолатеральную және апикальную облысы плазматической мембраналар поляризованных эпителийлі жасушалардың. Бұл домендер орындайды түрлі функциялары бар неодинаковый құрамы және физикалық бөлінуі бойынша жер бетінің жасушалары. Мембраналар тила-коидов » хлоропластах сондай-ақ бар доменді құрылымын; атап айтқанда, оларда бар тығыз іргелес бір-біріне мембраналық учаскелері және несоприкасающиеся облысы, құрамында әр түрлі элементтер жүйесі электрондық коммуникация. Бұл жеткілікті ұзын латеральные домендер болуы мүмкін есебінен спецификалық ақуыз-ақуыз өзара арасындағы мембрана немесе алдын ала келісілуі мүмкін болуын ең мембране арнайы құрылымдардың өзара іс-қимылымен компоненттерімен цитоскелета немесе агрегацией белоктар мембрананың жазықтығында. Бөлшектер осы өзара әзірге белгісіз.
Бұл мүмкіндіктер жұмыс істеуін шағын липидтік домендерді мембране, т. е. жекелеген учаскелерін олардың шегінде бис-лой бар ерекше физикалық қасиеттері және құрамы, онда бұл туралы айтуға болады аз определенностью. Модельді жүйелерде әр түрлі жағдайларда шын мәнінде байқалады латеральное бөлу және фазалардың, және алдамшы еді деп болжауға мұндай бөлу бар және биологиялық мембранах кезінде физиологиялық жағдайында. Мүмкін, бұл емес,-бислойные элементтері мембраналар немесе қандай да бір өтпелі құрылымдар.
Біз қарастырамыз асимметричное распределение мембраналық ақуыздардың және липидтердің. Жалпы алғанда, бұл барлық облысы деп атауға болады мембраналық топографией. Мұнда жатады және сипаттамасы цитоскелета, өйткені ол, шамасы, маңызды рөл атқарады ұйымдастыру белоктар және, мүмкін, липидтердің плазматической мембране эукариот.
1. Топография мембраналық белоктар
Мембраналық белоктар енгізілген бислой асимметрично, және бұл асимметрия реттеледі кинетическими факторлар. Активтендіру энергиясы үшін қайта бағдарлау ақуыз мембране кезде полярлық және зарядталған қалдықтары, әдетте жүрген жер бетінде, ең болмаса уақытша көрсетіледі гидрофобной облысы бислоя, өте жоғары. Дегенмен белгілі, кейбір мембраналық белоктар диффундируют бойында бислоя және/немесе айналасында осіне перпендикуляр оның бетінде жоқ екені туралы деректердің қандай да бір спонтанды ауыстыру өзгеруіне әкелуі мүмкін транс-мембраналық бағдарлау ақуыз қатысты екі тараптарға бислоя.
Бұл бөлімде шолу негізгі эксперименттік тәсілдерді анықтау трансмембранной бағдарлау ақуыздардың би-қабатында. Көптеген жолдары бар, мүмкіндік беретін алдын ала оқшаулау спираль, пронизывающих мембрана негізге ала отырып, бастапқы реттілігі осы ақуыз. Бір жағдайларда бұл болжау болып табылады жеткілікті дәл және келісіледі нәтижелерімен эксперименттік зерттеулер, басқа да ықпал жасауға мүмкіндік жоқ алу мүмкін емес. Бірде-бір моделі, құрылған компьютер арқылы, түпкілікті болып табылмайды, ол тек қана бастапқы нүкте үшін талдау. Өте анық, бұл кез келген егжей-тегжейлі зерттеу интегралдық мембраналық ақуыз қамтуы тиіс эксперименттік зерттеу оның топография. Бұл кейде оңай емес, және жиі құру үшін барабар моделін қолдануға тура келеді бірнеше тәсілдерді, өйткені бірде-бір әдісі жоқ сақтандырылмаған қателер. Егжей-тегжейлі қарау, жеке эксперименттік әдістерді арналған пікірлер.
1.1 Әдіснамасы протеолиз
Пайдалану протеазалар белсенділігін тежейді анықтау үшін топография белоктар бірқатар жағдайларда сөйтсе ғана жемісті. Бағытталған мембраналық препарат, құрамында оқылатын ақуыз, өңдейді протеолитическим ферментом және орындары бойынша ажырату белгілейді сол учаскелері полипептида, олар сыртқы жағынан мембраналар. Шешуші сәт болып табылады дайындау мембраналардың бастап бір таңбалы топологической бағдарланған; тек осы жағдайда ғана болуы мүмкін барабар нәтижелерін түсіндіру бөлінуіне меңгерілетін ақуыз. Кейбір мембраналар үйренуге болады алдын ала бөлу. Алайда, көптеген жағдайларда қажет мұқият алу топологически бағытталған препаратты вывернутой мембраной немесе мембраной бар нативную бағдарлауды. Мұндай препараттар алынды арналған мембраналар эритроциттердің, плазматических мембраналар кейбір эукариоттық жасушалардың ішкі митохондриальных мембраналар, мембраналардың саркоплазматического рети-кулума және кейбір бактериялық мембраналар. Жекелеген жағдайларда мүмкін емес зерттеу оқшаулау нақты ақуыз, арнайы кірістірілген қр бағдарланған мембрана қайта жаңартылған протеолипосом. Биологиялық мембранах басқа меңгерілетін ақуыз жиі орналасқан және басқа да белоктар. Егер оқылатын белок басым болса, онда өнімдері протеолиза бөлуге болады және сипаттау. Егер ол болып табылады минорным белковым компоненті болса, сәйкестендіру үшін үзінділерін пайдалануға тура келеді жанама әдістерін қолданумен байланысты арнайы антиденелердің немесе химиялық реагенттерді, кейіннен электрофорезом » ПААГ қатысуымен ДСН. Маңызды екендігіне көз жеткізу ғана учаскелері ақуыз, олар үшін қолжетімсіз ыдырату ұшырамайды гидролизу-мембраналардың зақымдануы кезінде бастапқы протеолизе. Қажет, сондай-ақ тез және обратимо кедергі күш протеа-зы, өйткені осы көптеген ферменттердің белсенді болып қалады тіпті кейін қосу ДСН алдында электрофорезом. Ескеру керек, бұл болмауы ажырату әлі ештеңе білдіреді, өйткені ықтимал орындары ыдырату сыртқы бетінде істемеуі мүмкін үшін протеаза ерекшеліктеріне үшінші құрылымдар мембраналық ақуыз.
Бұл көптеген еритін белоктар, протеолиз міндетті емес маңызды өзгерістерімен сүйемелденеді үшінші немесе четвертичной құрылымы мембраналық ақуыз insitu, бірақ оның биологиялық функциясы болуы мүмкін толығымен жойылған. Жағдайларда кезде расщеплении бір немесе екі баласы белсенділігі жоғалады көмегімен протеолиза сәйкестендіруге болады және тіпті бөлу функционалдық маңызды домендер ақуыз.
Мысал ретінде, иллюстрирующих пайдалану протеоли-тических ферменттердің келтіруге болады ақуыз жолағы 3 эритроциттер, бактериородопсин, лактозопермеазу Е. coliи субъединицу IV цитохром с оксидазы.
Иммунологиялық әдістері
Өте бағалы құралы анықтау үшін топография мембраналық белоктар болып табылады спецификалық антиденелер. Бұл жағдайда зерттейді байлау антиденелердің ақуыздарымен ғана бағдарланған мембраналық препараттар типті мембраналық везикул Е. coli. Талдау жасауға болады сандық, егер тиісті пайдалану иммунологиялық әдістері. Орындар байланысу болады ауыздықтау арқылы электрондық микроскопия, пометив антиденелер коллоидным алтынмен немесе пайдалана отырып, алтын, байланысты со специфичным кешені антиген—антидене бетінде мембраналар. Анық, бұл дайындау барысында мембраналық препараттың тиіс разрушаться нативные топографиялық құрылымы. Қарағанда дәлірек айтсақ туралы деректер жерлерде байланыстыру антиденелердің, информативнее осы эксперименттер. Егер зерттеуге бағытталған мембрананың қалыпты немесе вывернутой бағдарланып, онда көмегімен поли-клональных қарсы антиденелердің белгілі бір тазаланған полипептидного бөлігін анықтауға болады ма оқылатын белок учаскелері, суреттері айқындалмаған қандай да болмасын бір тарапқа мембраналар. Алайда, мұндай эксперименттер анықтауға мүмкіндік бермейді, қандай бөлігі ақуыз экспонирована. Егжей-тегжейлі ақпаратты алуға болады көмегімен екі тәсілдер. Бір тұрады пайдалану әб-ноклональных антиденелер, ал екінші қолдануды қарастырады поли-клональных антиденелер қарсы пептидтер, тиісті белгілі бір облыстар ақуыз.
Ең пайдалы сол, олар байланысады ретінде ақуыз в мембране, сондай-ақ денатурированными фрагменттерімен ақуыз, зерттеуге мүмкіндік береді белоктар кейін оларды бөлу арқылы электрофорез ПААГ қатысуымен ДСН. Бұл әсіресе маңызды болып табылады оқшаулау үшін орындар байланысу антиденелердің арналған полипептиде. Негізінен эпитоп болады оқшаулауға дейінгі дәлдікпен бірнеше аминоқышқыл қалдықтары. Мысал ретінде табысты пайдалану моноклонды антиденелерді келтіруге болады родопсин, бактериородопсин, ацетилхолиновый рецепторлардың және белок LamB — рецепторлардың фага Х-сыртқы мембрана Е. coli.