Аффинді иммуносорбенттер. Радиоактивті изотоптарды пайдалану

Аффинді иммуносорбенттер. Радиоактивті изотоптарды пайдалану

Жоғары дәрежесі таңдалған байланыс антиген — антидене ашады құру болашағын аффинных хроматографических колонкаларды тазарту үшін кез-келген ақуыз жоқ сияқты ферментам және басқа да биологиялық ұқсас парам, өзінің ерекше серіктестер. Жалпы іс-қимыл жоспары мұнда мынадай:

1. Иммунизировать қоян неким жақсы очищенным ақуыз.

2. Сол белок ковалентно бекіте матрицасы, мысалы, бағанасында BrCN-активтендірілген сефарозы.

3. Иммундық антисыворотку қан қоян жіберіп арқылы бұл бағанаға. Барлық басқа антиденелер оңай жуып, ерекше үшін ақуыз антиденелер оған қалады.

4. Оларды кейін алып тастау өзгеруіне рН буфер немесе берумен концентрациясы жоғары тұз. (Антиденелер жақсы сақталады)

5. Егер біз сумеем сенімді отырғызу осы антиденелер басқа бағанға, әрі, сондықтан олар утратят қабілетін байланысуға өзінің антигенмен болса, онда оның көмегімен болады үйренген кез-келген күрделі қоспалар сол ақуыз, ол бізді қызықтырады, ал содан кейін алып тастау және оны мүлдем тазартылған күйдегі»

Нақтылау үшін жүзеге асыру тәсілін осы жоспар бізге қосымша мәліметтер құрылымы және қасиеттері антиденелер. Біріншіден, кетуіме нақты орналасқан жері антиденелердің қан құрамында.

Егер қан құйса шыны түтікке және күту әзірге ол свернется, содан кейін центрифугалау тұнба алып тастау болса, онда онымен кетеді және қызыл қан жасушалары (эритроциттер) жəне ақ (лейкоциттер және лимфоциттер) және белок фибриноген, ол жүзеге асырады, ұйыту.

Қалады мөлдір сұйықтық, деп аталатын қан сарысуынан. Онда еруі қант, гормондар, витаминдер, тұздар мен басқа да низкомолекулярные заттар, сондай-ақ әр түрлі және көптеген белоктар қан. Олардың негізгі массасын құрайды екі сынып белоктар: альбуминдер және глобулиндер. Олардың бөлуге болады қосылған аммоний сульфаты дейін концентрациясының 2М.

Глобулиндер алдым да тұнба. Егер барлық сарысуды қаралса, фракционированию электрофорезом кезінде рН8,6, онда алға тез кетеді, альбуминдер, содан кейін ал-, (3-ші у-глобулиндер.

Міне, осы соңғы фракциялары деп аталатын иммуноглобулиндер және олар антиденелер. Бірнеше типтері иммуноглобулиндер. Оның бай басқа да ұсынылды қан үшін пайдаланылады зерттеу мақсаттары бір — иммуноглобулин үлгідегі G, обозначаемый IgG.

Қан сарысуын жануарлар, успевшего әзірлеу «иммунды жауап», яғни антиденелер тән енгізілген сырттан антигенін, деп атайды антисывороткой.

Кейде оны толық атауында көрсетеді және стимулировавший бұл антисыворотку антиген және тіпті оның шығу тегі. Мысалы, «антисыворотка қоян эритроциттеріне қарсы қозы».

Атауы ұзын, бірақ толық сипаттайды нақты жағдай: қанға қоян енгізілді эритроциттер қан қозы. Олар — бөтен, сондықтан туғызды иммундық жауабы бар.

Себебі айтқанда, адамның белгілі төрт нұсқасы: IgGI дейін IgG4, тағы біраз саны басқа иммуноглобулиндер: IgM, IgA, IgE, ойнайтын бірнеше әр түрлі рөлдер.

Бірақ біз бұл бөлшектер терең бойлау жоқ боламыз. Айырмашылықтар олардың құрылымдар мардымсыз және 60% астам үлесіне тиесілі IgGI. Міне оның біз бұдан әрі білдіруге термині «антидене». Молекулалық массасы IgGI құрайды 146 мың дальтон.

Барлық оның кеңістіктік конфигурациясы орнатылды әдісі рентгенді құрылымдық талдау. Электронды микроскоппен антидене көрінеді тәріздес латын әрпін «Y».

Оның «стержне» және екі «тармақтарында» болады айыра жекелеген учаскелері («домендер»), полипептид тізбегі ақуыз скручена және құрады әлдебір ұқсастық полусферы ретінде бейнеленген-сур.1.

Сур. 1

Белгілісі-суретте парность домендерді көрсетеді нақты ұқсастық құрылыстар мүшелерінің әрбір жұп, бірақ барлық олар водородными, гидрофильными, ал ең бастысы — дисульфидными көпірлермен байланысты бір молекула бар.

Ең бастысы, бұл жағдай барлық төрт домен «өзек» және жақын оған жұп домендерді «бұтақ» — білім өзінің аминқышқылды құрамы мен құрлысы барлық антиденелерді («константная бөлігі»).

Тек екі жұп шеткі домен білдіреді вариабильную бөлігі антиденелер анықтайтын оның антигенную ерекшелігі. Осы доменах бар учаскелері, олар деп аталады «гипервариабильными облыстары» (сур. — заштрихованы).

Оларда айырмашылықтар антиденелердің үшін ерекшелігі әр түрлі антигендер, әсіресе айқын көрініс табады. Әрбір жұпта шеткі домен олар құрайды әлдебір ұқсастық «шатқал».

Күтуге болады, бұл дәл осы жерде байланысады антиген. Мұндай болжам таппады тікелей растау кейін анықталғандай, кристаллизовать соңғы фрагменті бір антиденелердің бірге онымен байланысты антигенмен (с дәрумені).

Талдау рентгенограммы көрсеткендей, молекуласы а витаминінің жатыр «шатқалы мен» тану және оның әр түрлі бөліктері сближены және өзара іс-қимыл белгілі бір амин » гипервариабильной.

— Сур. бейнеленген кеңістіктік конфигурациясы бір вариабильных шеткі домен IgGl. Полипептидная тізбек 104 амин қышқылдарының свернута, сондықтан оның заштрихованных (гипервариабильных) учаскесінің шығады беті домен шамамен бір жазықтықта құра отырып, бір баурайларының «шатқал».

Нүктесі осы суретте орны белгіленген қосылыстар парным доменом шеттері бір бұтағы, образующим екінші беткейі. Аминокислотный құрамы гипервариабильных учаскелерінің екі тау баурайларында, әрине, әртүрлі. Бірақ «шатқалында» соңында екінші бұтағы молекулалар антиденелер болып табылады дәл көшірмесімен «шатқалының» бірінші бұтағы.

Тікелей облысы тану және байланысу антигенін «шатқалында» соңында бұтақтары құрайтын 20-ға жуық амин қышқылдары. Бірақ әлі кемінде 70 амин қышқылдарының әрбір шеткі домен қатысады айқындау кеңістіктік конфигурациясы.

Бірақ оралайық бағдарлама құру аффинно-иммундық колонкалар. Түсінікті іске асыру мүмкіндігін төрт оның бірінші пункт. Сарысуынан иммунизированного қоян, двухмолярным ерітіндісімен аммоний сульфаты осаждают жиынтық глобулиндер фракциясы.

Содан кейін оны ерітеді, диализбен босатады тұз жағады да буфере рН6,5-бағанға ДЕАЕ-целлюлоза. Мұндай рН мәні IgG кешіктірілмейді » бағанасында шығады бірден очищенным, өйткені барлық басқа глобулиндер қалады бағанасында.

Бір уақытта дайындайды бағанға негізінде BrCN-активтендірілген сефарозы және тіркейді, ондағы ақуыз, ол » иммунизирован қоян. Ерітінді жиынтық фракциясының IgG босататын арқылы бұл бағанаға және жуылады оның буферінің арқылы. Нәтижесінде бағанадағы ұстайды ғана антиденелер тән бұл ақуыз-антигенін. Оларды алып тастауға болады 0,1 М сірке қышқылының ерітіндісімен немесе 4,5 М ерітіндісімен MgClg. Осылайша алынған ерітінді керекті антиденелерді жояды, диализуют жылғы тұздар және, егер керек, бөлігін шоғырландырады упариванием су.

Енді соңғы сұрақ туындайды. Қалай байланыстыруға бұл антиденелер с матрицасында бір бағана, әрі сол үшін жапа шегіп, олардың антигенная белсенділігі мен ерекшелігі? Қиын сұрақ!

Бірақ мұнда табиғат жасады зерттеушілер үшін керемет сыйлық. Бұл бір ақуыз бірі қабық бактериялар Staphylococcus aureus, аталған «ақуыз» А, қабілетті берік байланыса отырып, өзгермейтін бөлігі («өзегі») көптеген IgG.

Соңғы сөз «болып шықты» жасырынып көп. Екіталай белок осындай қасиеті арнайы іздеген дәл осы бактериялар. Ең алдымен оның кездейсоқ табылған. (Бірақ, дейді мақал, ғалым кім көреді, көреді, бірақ көңіл бөлінуі керек деп ешкім!).

Сондықтан немесе әйтпесе, бірақ табу көрсетілген қасиеттері ақуыз А жол ашты жүзеге асыруға соңғы кезеңде біздің бағдарлама. «Бағанға активтендірілген сефарозы химиялық берік сажают ақуыз А (тіпті сатуға дайын «Protein — Sepharose CL-4В») және ол арқылы белгілі бір жағдайларда әкеледі ерітіндісі спецификалық антиденелер. Олар бекітіледі бағанасында арқылы өз өзектер мен ақуыз.

Екі жаққа тармақтану орыны бос қалады. Мақала дайын — құрылды аффинный иммуносорбент үшін дереу тазалау кез келген белок қоспасын қатар ақуыз, ол үшін пайдаланылуы иммундау қоян. Оны колонкалар кейін тазарту ұсынады еңбек қышқылы немесе тұз…

Аффинные иммуносорбенты кең қолданыс тапты және, айтпақшы, ғана емес, тазалау үшін белоктар. 1978 ж. Stumphet алдық бұл әдіспен қоспасынан фрагменттерін ядролық ДНҚ бөліп гибридті ДНК-РНК кесектері. Осы гибридам анықтады гендер жауапты синтезі рибосомальных РНҚ. (Қоян бұл жағдайда иммунизировали двухнитевым синтетикалық гибридом полиадениловой қышқылы және полидезоксириботимидиновой қышқылы) бұл мұндай будан өте жақсы имитирует қатысты мамандандыру антиденелердің будан ДНҚ-РНҚ.

Жерін анықтау антигенін кейін электрофорез қоспалар белоктар

Бұл — тағы бір өте пайдалы пайдалану нұсқасы иммуноспецифического байланыстыру антиденелердің олардың антигенами. Деп аталатын бұл сүреден кейін бөлу қоспалар белоктар электрофорезом » ПААГ сонда үлкен саны ақуыз жолақтар, оның біреуі болуы тиіс искомый ақуыз.

Здесь можно комбинациясы таңдалған иммуноспецифического байланыстыру өте сезімтал тәсілімен пайдалану радиоактивтілік. Қызықтыратын зерттеуші ақуыз иммундайды қоян және тазартады, оның қан антисыворотку. Әзірленді және бар-жоғы арнайы, деп аталатын «диазобумага».

Ол білу қабілеті, өзінің белсенді диазогруппам ковалентті химиялық байланыспен присоединять кез келген белоктар.

Аяқталғаннан кейін электрофорез жоғарғы бетінің гель сүзгіш қағазбен алып тастайды артық ылғал және салады, оған диазобумагу, белгілеп қойып, оның жағдайын суықтық проколами екі бұрыштары қағаздар және гель. Содан кейін осы жұп гельмен төменге орналастырады жүйесіне «блоттинга», көшіру үшін ДНК-ның агарозного гельдің нитроцеллюлозный сүзгі.

Яғни салады гель парағы толстой, сүзгіш қағаздар, үнемі смачиваемой буферінің арқылы, ал диазобумагу жүктейтін стопку сүзгіш қағаз арқылы пластинку шыны прижимают жүгі бар. Токпен сұйықтық берілетін жоғары капиллярам бөлігі белоктар әрбір жолақ көшіріледі диазобумагу және онда мықтап бекітіледі.